银染样品
无尘纸擦拭实验台，保持试验台干净。弃去上清的过程中tube开口对着外部，枪头不要碰到胶，样品之间不做对比，可以不换枪头。
1. 洗胶。1mL 脱色液：50%ACN-NH4HCO3（50mM）震荡5min（震荡速度适中，800rpm），弃上清，再次加入上述溶液清洗3次。
2. 弃去上清，加1mL H2O震荡10-15分钟（震荡速度降低，500rpm），使胶溶胀。水洗的同时配脱色液：100mM 铁氰化钾/30mM硫代硫酸钠。每个样品大约各加100微升。
配制方法：硫代硫酸钠：24.8mg+1mL H2O，铁氰化钾：10mg+1mL H2O。
3. 脱色。弃去上清，溶液尽量吸干净。向每个样品加入硫代硫酸钠和铁氰化钾各100微升(根据胶体积自行调整)，溶液应没过胶的体积。震荡脱色2-3min至胶与溶液颜色相同（此时胶呈现黄色）。
4. 弃去上清，溶液吸干净。1mL H2O震荡10-15 min两次至胶无色。
5. 切胶。准备同样数量的空tube，各加100微升脱色液，与原始样品标注相同。按照由浅至深的顺序切胶，每次切胶后清洗玻璃板和刀片、镊子。切胶时首先将玻璃板用水-甲醇-水由内到外擦干净，分别用水和甲醇洗涤刀片。切成1mm3大小后，用镊子将刀片上的以及切好的胶全部转移至新的tube中。
6. 脱水。加入200uL 乙腈涡旋，使胶充分缩水变白（两次，根据胶状态判断）。
7. 断二硫键。弃去乙腈，将溶液吸干净，在通风橱中开盖晾5分钟。加入DTT溶液100微升左右（根据胶体积判断，没过胶），终浓度25mM，50度金属浴30min。
8. 保护断键位点。样品冷至室温后弃去上清，将溶液吸干净。加入IAA溶液100微升（根据胶体积判断，没过胶），终浓度为50mM。锡箔纸包好抽屉反应30min-1h。
9. 脱色液Wash2次，震荡吸弃。
10. 脱水。加200uL左右ACN脱水2次至胶完全干燥（根据胶状态判断），在通风橱中开盖晾5分钟。
11. 加酶。酶的母液浓度为5ug/uL。加入酶溶液终浓度为10ng/uL。每个样品加30ul（按胶的大小），冰上孵育5-10分钟后进一步看溶液体积是否合适。枪头尽量靠近胶，但不要碰到胶，加完后如果有干胶，再加酶入溶液，最后补加碳酸氢铵至溶液没过胶。加完酶后样品要放在冰上，快速涡旋和离心，防止酶解。室温酶解过夜或37摄氏度4-6小时。
12. 提取。准备准备同样数量的空tube，标注相同，带星号区分，收集管提前放到冰上预冷。酶解样品开盖前先离心，之后的步骤开盖之前都要离心。50%ACN-H2O+1%TFA（一倍于总体积）终止酶解，震荡10-15min，吸取上清加入到新的管子中；50%ACN +0.1%TFA Buffer（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；70%ACN+0.1%TFA（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；90%ACN+0.1%TFA（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；此时看胶的状态，如果已经非常干燥就可以终止，如果胶仍未干燥完全则进一步加入100%ACN一倍胶体积完全挤出溶液。
13. 冻干，-80度保存。
考染样品
无尘纸擦拭实验台，保持试验台干净。弃去上清的过程中tube开口对着外部，枪头不要碰到胶，样品之间不做对比，可以不换枪头。
1. 切胶。准备同样数量的空tube，各加200微升脱色液，与原始样品标注相同。按照由浅至深的顺序切胶，每次切胶后清洗玻璃板和刀片、镊子。切胶时首先将玻璃板用水-甲醇-水由内到外擦干净，分别用水和甲醇洗涤刀片。切成1mm3大小后，用镊子将刀片上的以及切好的胶全部转移至新的tube中。
2. 脱色。1mL 脱色液：50%ACN-NH4HCO3（50mM）震荡10min（震荡速度适中，800rpm），弃上清，再次加入上述溶液清洗3次直到完全脱到无色。
3. 脱水。加入200uL 乙腈涡旋，使胶充分缩水变白（根据胶状态判断）。
4. 断二硫键。弃去乙腈，将溶液吸干净，在通风橱中开盖晾5分钟。加入DTT溶液100微升左右（根据胶体积判断，没过胶），终浓度25mM，50度金属浴30min。
5. 保护断键位点。样品冷至室温后弃去上清，将溶液吸干净。加入IAA溶液100微升（根据胶体积判断，没过胶），终浓度为50mM。锡箔纸包好抽屉反应30min-1h。
6. 脱色液Wash2次，震荡吸弃。
7. 脱水。加200uL左右ACN脱水2次至胶完全干燥（根据胶状态判断），在通风橱中开盖晾5分钟。
8. 加酶。酶的母液浓度为0.5ug/uL。加入酶溶液终浓度为10ng/uL。每个样品加30ul（按胶的大小），冰上孵育5-10分钟后进一步看溶液体积是否合适。枪头尽量靠近胶，但不要碰到胶，加完后如果有干胶，再加酶入溶液，最后补加碳酸氢铵至溶液没过胶。加完酶后样品要放在冰上，快速涡旋和离心，防止酶解。室温酶解过夜或37摄氏度4-6小时。
9. 提取。准备准备同样数量的空tube，标注相同，带星号区分，收集管提前放到冰上预冷。酶解样品开盖前先离心，之后的步骤开盖之前都要离心。50%ACN-H2O+1%TFA（一倍于总体积）终止酶解，震荡10-15min，吸取上清加入到新的管子中；50%ACN +0.1%TFA Buffer（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；70%ACN+0.1%TFA（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；90%ACN+0.1%TFA（体积为胶体积的2-3倍）吸取上清加入到新的管子中，10-15min；此时看胶的状态，如果已经非常干燥就可以终止，如果胶仍未干燥完全则进一步加入100%ACN一倍胶体积完全挤出溶液。
10. 冻干，-80度保存。
